壞死是由細(xì)胞外部因素(如缺氧)引起的一種細(xì)胞死亡形式，它通常與乳腺、結(jié)腸、腦、肺、腎和胰腺中迅速生長(zhǎng)的惡性腫瘤有關(guān)。有效并快速地鑒別腫瘤壞死區(qū)域能夠提供早期復(fù)發(fā)或死亡的預(yù)后信息，從而幫助癌癥的診斷與治療。

　　質(zhì)譜作為一種高靈敏分析技術(shù)可對(duì)分析樣品進(jìn)行快速檢測(cè)，并提供樣品組分的質(zhì)譜輪廓圖信息。解吸電噴霧電離質(zhì)譜(DESI-MS)技術(shù)是目前廣泛使用的質(zhì)譜成像技術(shù)之一，其結(jié)合了質(zhì)譜技術(shù)與成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，可用于獲取樣本組分在空間的分布情況，有利于腫瘤壞死區(qū)域的準(zhǔn)確識(shí)別。為縮短檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)輔助使用旋光測(cè)定技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DESI-MS對(duì)腫瘤切片的快速空間靶向檢測(cè)分析，使分析時(shí)間縮短至2 min。

　　實(shí)驗(yàn)方法

　　雌性小鼠的乳腺癌腫瘤組織，液氮冷凍后在冷凍切片機(jī)上以10 μm厚度切片，固定于載玻片，于-80 ℃貯存待用。

　　對(duì)10 μm腫瘤切片采用自制旋光成像系統(tǒng)進(jìn)行旋光測(cè)定，根據(jù)旋光圖像顯示的極化異質(zhì)性區(qū)域?qū)M織切片進(jìn)行靶向DESI-MS成像分析。采用DESI源與Waters Xevo G2-XS Q-Tof系統(tǒng)，噴霧溶劑采用ACN/DMF(v/v 1:1)+150 pg/μL LE，流速1 μL/min，毛細(xì)管電壓3.6 kV，霧化氣壓力100 psi，掃描速度100 μm/s，空間分辨率100 μm，負(fù)離子模式采集。

　　使用沃特世高清成像軟件(HDI)處理質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)。

　　結(jié)果與討論

　　圖1所示為壞死性乳腺癌腫瘤的DESI-MS成像結(jié)果。根據(jù)離子成像圖以及質(zhì)譜圖，可以看到，已知生物標(biāo)記物油酸m/z 281.25以及花生四烯酸m/z 303.2主要存在于壞死組織，而腎上腺素酸m/z 331.26主要存在于非壞死組織，這與已有研究結(jié)果相匹配;此外，我們還發(fā)現(xiàn)m/z 574.48(暫定為[Cer(d34:1) + Cl]-)僅存在于壞死組織，m/z 391.25僅存在于非壞死組織，利用這兩種物質(zhì)的疊加圖可以顯示整個(gè)腫瘤切片的壞死與非壞死區(qū)域輪廓圖。以上DESI-MS成像數(shù)據(jù)與H&E、Pan-CK染色圖像所示的病理學(xué)分析數(shù)據(jù)一致，進(jìn)一步證實(shí)了DESI-MS檢測(cè)數(shù)據(jù)的可信度。

　　然而，要得到整個(gè)腫瘤切片的DESI-MS成像圖需耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)條件下所耗時(shí)長(zhǎng)為5 h，因此該檢測(cè)方法并不適用于術(shù)中腫瘤壞死區(qū)域的快速識(shí)別。這里，我們采用旋光測(cè)定技術(shù)，根據(jù)壞死區(qū)域組織結(jié)構(gòu)的改變，測(cè)定組織的光學(xué)去極化率，從而使DESI-MS分析靶向化，大大縮短分析時(shí)間。圖2a為腫瘤切片的H&E成像，可以看到圖2b顯示的極化異質(zhì)性區(qū)域與病理學(xué)上的壞死區(qū)域有很大的關(guān)聯(lián)性。根據(jù)偏振圖像中的極化異質(zhì)性區(qū)域進(jìn)行靶向DESI-MS采集，可以得到包含生物標(biāo)記物的質(zhì)譜圖(圖2c)，從而快速鑒別腫瘤壞死區(qū)域，如此可將整個(gè)分析時(shí)間縮短至2 min以?xún)?nèi)。

　　總結(jié)

　　DESI-MS質(zhì)譜成像技術(shù)可用于乳腺癌腫瘤壞死區(qū)域的準(zhǔn)確識(shí)別，輔助使用旋光測(cè)定技術(shù)可以引導(dǎo)DESI-MS進(jìn)行靶向性的檢測(cè)分析，從而大大縮短術(shù)中的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)。