隨著改變生命的治療方法的出現(xiàn)，生物制藥的未來前景廣闊，2018 年的諾貝爾獎更是授予了免疫檢查點療法，基于這一療法的 PD-1 正在拯救更多癌癥病人的生命，推動這些新型生物治療藥物安全地應用于臨床需要可靠的生產(chǎn)和質量控制過程。生物治療藥物復雜的異質性需要借助準確而穩(wěn)定的分析檢測方法進行分析，并需要可靠的色譜分離。

鑒定關鍵質量屬性(CQA) 是實施質量源于設計 (QbD) 原則以開發(fā)和生產(chǎn)生物藥物的過程中最困難的一步。定義各種產(chǎn)品屬性極具挑戰(zhàn)性，因此，產(chǎn)品質量的一致性變得更加重要。滴度測定、糖鏈分析、電荷異構體分析、氨基酸和培養(yǎng)基分析、肽譜分析、聚集體分析、完整蛋白和亞基分析都是關鍵質量屬性重要的技術，然而想要成功地獲取最佳的實驗結果，需要操作者能切中要害，找到關鍵之處，讓我們也一起來“劃重點”說一下這些技術的難點以及關鍵所在。

滴度測定

技術應用

滴度測定是對于單克隆抗體，最有效的滴度測定方法之一是親和色譜法。選擇 Protein A 或Protein G 色譜柱時，首先要考慮的是待純化或分析的目標蛋白質，再選擇合適的流動相和樣品方法。

實驗痛點

您可能并沒有注意到洗脫液對基線噪音以及色譜柱壽命的影響，也并不清楚如何最大程度延長這些“有生命”的色譜柱壽命，然而這正是容易被您忽視的關鍵所在。

快速有效的糖鏈分析

技術應用

翻譯后修飾( PTM )可能形成許多不同類型的異構體。糖基化尤其高度可變，而糖基化對于許多蛋白質的功效具有重大影響。FDA 認為這是一項重大挑戰(zhàn)，并就如何確定糖指紋譜提供了指導。

實驗痛點

如何獲取難分離糖鏈結構的最佳分離度？為此具體的方法條件都包含什么？例如，A 柱和 B 柱的選擇？儀器的選用？柱溫、流動相、 FLD、進樣量等應如何選擇和設置？不僅如此，如何能夠快速的獲取有效的實驗結果是整個方法優(yōu)化的痛點所在。

電荷異構體分析

技術應用

離子交換色譜可以分離一些電荷異構體，特別是那些位于蛋白質表面（而不是隱藏在結構內(nèi)）的電荷異構體。由于大多數(shù)蛋白質所含的堿性氨基酸多于酸性氨基酸，因此大多數(shù)電荷異構體分離需要采用陽離子交換。

實驗痛點

從離子交換 ( IEX ) 色譜的使用、色譜柱選擇，流動相的重要注意事項、到IEX 的一般使用經(jīng)驗規(guī)則都是電荷異構體分析能否成功的關鍵，不僅如此，在操作中還有若干儀器注意事項，所以此項分析需要注意的關鍵點會非常多，需要操作者根據(jù)電荷異構體的不同情況，具體問題具體分析。

氨基酸和培養(yǎng)基分析

技術應用

氨基酸和培養(yǎng)基分析主要用于確定蛋白質的氨基酸組成與其他技術一起使用以確認正確的結構。氨基酸也是用于制備重組蛋白質的細胞培養(yǎng)基中的關鍵成分。氨基酸本身屬于兩性離子，并具有各種側鏈，它們還缺少合適的UV 發(fā)色團，使得分離和檢測氨基酸非常具有挑戰(zhàn)性。

實驗痛點

如何實現(xiàn)所有常見氨基酸的基線分離并確保符合歐洲藥典的系統(tǒng)適用性，這是非常挑戰(zhàn)實驗員操作水平的。

肽譜分析

技術應用

肽譜分析是一項強大的技術，可用于全面鑒定蛋白質的一級結構，還能夠區(qū)分蛋白質內(nèi)異構基團的精確位置。使用這種方法，蛋白質將被分解成單獨的片段，然后將這些物質分離成經(jīng)典的“指紋”色譜圖。將分離與質譜檢測相結合，能夠將肽譜分析色譜圖中觀察到的實際的峰與分析軟件預測的預期片段相關聯(lián)。

實驗痛點

要成功生成肽譜，需仔細檢查完整的表征策略。其中樣品前處理對于成功的肽譜分析至關重要，這可能是一個耗時的過程，可能需要針對待酶解的各種蛋白質優(yōu)化多個步驟。然而打好基礎熟練掌握肽譜分析流程的基本技術才是成功的第一步，此外，進行肽譜分離優(yōu)化時需要注意諸如覆蓋率等事項，才能盡可能獲得最佳結果。

聚集體分析

技術應用

體積排阻色譜是特別適合從高階聚集體中分離單體峰的技術之一。隨著技術發(fā)展，人們將目光投向了除單克隆抗體以外的蛋白質藥物?？贵w藥物偶聯(lián)物等更為復雜分子的聚集體表征可能更具挑戰(zhàn)性，因為疏水性細胞毒性藥物的存在可能導致許多體積排阻色譜柱無法發(fā)揮理想性能。使用可顯著降低次級相互作用風險的新型固定相，將非常適合聚合物的快速分離和定量。

實驗痛點

聚集體分析中，如何確保穩(wěn)定可靠運行SEC分析，使用何種條件才能確保分析過程中蛋白質穩(wěn)定，以及怎樣維護這一易耗品，是該分析獲取有效實驗結果的關鍵。

完整蛋白和亞基分析

技術應用

完整蛋白和亞基分析可以用來比較生物仿制藥與原研藥。在反相條件下，分子很可能發(fā)生變性。樣品保留在色譜柱上得到濃縮，且適用于質譜分析。因此，該技術適用于測定完整蛋白和亞基分析的精確質量數(shù)。

實驗痛點

如何考慮選擇完整蛋白和亞基分析色譜柱的多個相互關聯(lián)因素：樣品分子量和最適合的填料孔徑，色譜柱固定相，流動相條件，以及速度或通量要求等。這些都是完整蛋白和亞基分析的關鍵。